As duas fórmulas: Wallace e Nearest-Neighbor
A regra de Wallace conta bases: cada A ou T soma 2 °C, cada G ou C soma 4 °C.
Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C)
É rápida, mas só foi validada para primers de 14 a 20 bases, em torno de 50 mM de sal monovalente — fora dessa faixa, o erro cresce. O Nearest-Neighbor (SantaLucia, 1998) soma a energia livre de cada par de bases empilhado com o vizinho, mais a penalidade de iniciação nas pontas, e converte para temperatura:
Tm = (ΔH° × 1000) ÷ (ΔS° + R × ln(CT/x)) − 273,15
- ΔH°, ΔS° — soma da entalpia e entropia de cada par empilhado (Tabela 1 de SantaLucia 1998), mais iniciação nas duas pontas.
- R — constante dos gases, 1,987 cal/(mol·K) (mesma unidade da tabela).
- CT — concentração total do primer, em mol/L.
- x — 4 para primers não autocomplementares (concentração igual nas duas fitas), ou 1 para sequências autocomplementares (palíndromos).
O ΔS° é então corrigido pela concentração de sal monovalente informada (mesmo artigo), porque o Tm sobe com mais sal disponível para neutralizar a repulsão dos fosfatos do DNA.
Exemplo resolvido — primer de 8 bases
Sequência 5'-GACTGCAT-3', sem autocomplementaridade, 50 mM Na⁺, 250 nM de primer:
| Par empilhado | ΔH° (kcal/mol) | ΔS° (cal/mol·K) |
|---|---|---|
| GA | −8,2 | −22,2 |
| AC (= espelho de GT) | −8,4 | −22,4 |
| CT | −7,8 | −21,0 |
| TG (= espelho de CA) | −8,5 | −22,7 |
| GC | −9,8 | −24,4 |
| CA | −8,5 | −22,7 |
| AT | −7,2 | −20,4 |
| Iniciação 5' (G) + 3' (T) | +0,1 +2,3 | −2,8 +4,1 |
ΔH° total = −56,0 kcal/mol · ΔS° total (1 M NaCl) = −154,5 cal/(mol·K)
ΔS° corrigido (50 mM Na⁺, 7 pares empilhados) ≈ −162,2 cal/(mol·K)
Tm = (−56.000) ÷ (−162,2 + 1,987 × ln(2,5×10⁻⁷ ÷ 4)) − 273,15 ≈ 13,8 °C
Este é o mesmo exemplo verificado em test.html, com os valores exatos que o código produz (a calculadora nunca arredonda antes de terminar a conta).
Comparando os dois métodos
| Primer | Comprimento | Wallace | Nearest-Neighbor | Observação |
|---|---|---|---|---|
| ATCGGCTAGCTAGCTTACGG | 20 nt | 62,0 °C | 55,6 °C | Dentro da faixa de Wallace — mesmo assim, 6,4 °C de diferença. |
| GCGACTGACTGACTGA | 16 nt | 50,0 °C | 49,7 °C | Dentro da faixa de Wallace, valores próximos. |
| ATCGATCGATCG | 12 nt | 36,0 °C | 36,0 °C | Fora da faixa recomendada de Wallace (14–20 nt) — use o Nearest-Neighbor. |
Temperatura de anelamento (Ta) e triagem de hairpin/dímero
A heurística usada aqui é Ta = Tm (Nearest-Neighbor) do primer de menor Tm entre o par, menos 5 °C — um ponto de partida comum em protocolos de desenho de PCR, a otimizar em bancada com um gradiente de temperatura. A triagem de hairpin/dímero verifica apenas se a extremidade 3' de um primer é complementar a outro trecho (da própria sequência ou do parceiro): é um alerta para revisão manual, não uma análise termodinâmica de estrutura secundária (não calcula ΔG de dobramento).
Perguntas frequentes
Qual a diferença entre a regra de Wallace e o método Nearest-Neighbor?
A regra de Wallace (Tm = 2×(A+T) + 4×(G+C)) é uma aproximação rápida, validada para primers de 14 a 20 bases em cerca de 50 mM de sal. O método Nearest-Neighbor (SantaLucia, 1998) soma a energia de empilhamento de cada par de bases vizinhas e é mais preciso para qualquer comprimento e qualquer concentração de sal — por isso é o valor que esta calculadora usa como resultado principal.
Como a calculadora sugere a temperatura de anelamento (Ta)?
Pela heurística padrão de desenho de PCR: Ta = Tm (Nearest-Neighbor) do primer de menor Tm entre o par, menos 5 °C. É um ponto de partida para otimizar em bancada, não um valor definitivo.
O que significa o alerta de hairpin ou dímero?
É uma triagem aproximada: verifica se a extremidade 3' do primer é complementar a outro trecho da própria sequência (hairpin/autodímero) ou do primer parceiro (dímero cruzado). Não é uma análise termodinâmica de estrutura secundária — sinaliza apenas candidatos a revisar manualmente ou em uma ferramenta de estrutura secundária dedicada.
Os dados da sequência saem do meu navegador?
Não. O cálculo roda inteiramente no seu navegador, em JavaScript. Nenhuma sequência, concentração ou resultado é enviado a este site ou a terceiros — você pode conferir na aba Rede das ferramentas do navegador (F12).
Esta calculadora substitui a otimização em bancada?
Não. Ela aplica fórmulas publicadas sobre os valores que você digita. A validação experimental da reação (gradiente de temperatura, controle negativo, eletroforese) continua sendo responsabilidade do responsável técnico do laboratório.
Fontes: SantaLucia J Jr. (1998), "A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics", PNAS 95(4):1460–1465 (Tabela 1, parâmetros unificados e correção de sal). Regra de Wallace: Suggs SV et al. (1981), ICN-UCLA Symp Dev Biol Using Purified Genes 23:683–693. Consultado em 22/09/2026.
Aviso: esta ferramenta apoia o cálculo de Tm e Ta a partir de fórmulas publicadas; não substitui a otimização experimental da reação nem a responsabilidade técnica do profissional habilitado do laboratório.